Identification of new human mesenchymal stem cell biomarker by aptamers / Identificação de novos biomarcadores de células tronco mesenquimais de origem humana por meio de aptâmeros

Stem cells are undifferentiated cells that can be distinguished from others by their ability to self-renew and to differentiate into new specific cell types. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells that can be obtained from different sources, such as adipose tissue, bone marrow, dental pulp, and umbilical cord. They can either replicate, originating new identical cells, or differentiate into cells of mesodermal origin and from other germ layers. MSC have been studied as new tools for regenerative therapy. Although encouraging results have been demonstrated, MSC-based therapies still face a great barrier: the difficulty of isolating these cells from heterogeneous environments. MSC are currently characterized by immunolabelling through a set of multiple surface membrane markers, including CD29, CD73, CD90 and CD105, which are also expressed by other cell types. Hence, the present work aimed to identify new specific biomarkers for the characterization of human MSC using DNA aptamers produced by the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) technique. Our results showed that MSC from different origins bound to DNA candidate aptamers, that is, DNA or RNA oligonucleotides selected from random libraries that bind specifically to biological targets. Aptamer-bound MSC could be isolated by fluorescenceactivated cell sorting (FACS) procedures, enhancing the induction of differentiation into specific phenotypes (chondrocytes, osteocytes and adipocytes) when compared to the whole MSC population. Flow cytometry analyses revealed that candidate aptamers bound to 50% of the MSC population from dental pulp and did not present significant binding rates to human fibroblasts or lymphocytes, both used as negative control. Moreover, immunofluorescence images and confocal analyses revealed staining of MSC by aptamers localized in the surfacemembrane of these cells. The results also showed internal staining of human monocytes by our investigated aptamers. A non-specific control aptamer (CNTR APT) obtained from the random pool was then utilized to compare the specificity of the aptamers bound to the analyzed non-apoptotic cells, showing no staining for MSC. However, 40% of the monocytes bound to the CNTR APT. Normalized data based on the cells bound to candidate aptamers compared to those bound to the CNTR APT, revealed a 10 to 16-fold higher binding rate for MSC against 2-fold for monocytes. Despite its low specificity, monocyte-aptamer binding occurs probably due to the expression of shared markers with MSC, since monocytes are derived from hematopoietic stem cells and are important for the immune system ability to internalize/phagocyte external molecules. Given that, we performed a pull-down assay followed by mass spectrometry analysis to detect which MSC-specific protein or other target epitope not coexpressed by monocytes or the CNTR APT would bind to the candidate aptamer. Distinguishing between MSC and monocyte epitopes is important, as both cells are involved in immunomodulatory effects after MSC transplantations. ADAM17 was found to be a target of the APT10, emerging as a possible biomarker of MSC, since its involvement in the inhibition of the TGF signaling cascade, which is responsible for the differentiation of MSC. Thus, MSC with a higher stemness profile should overexpress the protein ADAM17, which presents a catalytic site with affinity to APT10. Another target of Apt 10 is VAMP3, belonging to a transmembrane protein complex that is involved in endocytosis and exocytosis processes during immune and inflammatory responses. Overall, proteins identified as targets of APT10 may be cell surface MSC biomarkers, with importance for MSC-based cell and immune therapies

Células tronco são células indiferenciadas que podem ser distinguidas de outros tipos celulares por meio da habilidade de se auto renovarem e de se diferenciarem em novos tipos celulares. Células tronco mesenquimais (MSC) são células tronco adultas encontradas em diferentes tecidos como tecido adiposo, polpa de dente e cordão umbilical. Estas células podem se autodividir em células idênticas ou se diferenciarem em células de origem mesodermal. Estas células têm sido estudadas em novas aplicações que envolvem terapia regenerativas. Embora resultados encorajadores tenham sido demonstrados, terapias que utilizam MSC ainda encontram uma grande barreira: a dificuldade no isolamento destas células a partir de um ambiente heterogêneo. MSC são caracterizadas por populações positivas em ensaios de imunomarcação para os epítopos membranares CD29, CD73, CD90 e CD105, presentes também em outros tipos celulares. Assim, o presente trabalho tem o objetivo de identificar novos biomarcadores de MSC de origem humana, utilizando aptâmeros de DNA produzidos pela técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) como ferramenta. Nossos resultados mostraram que MSC de diferentes origens ligam-se a aptâmeros (oligonucleotídeos de DNA ou RNA que atuam como ligantes específicos de alvos moleculares) de DNA candidatos que atuam no isolamento de MSC por meio da técnica FACS de separação celular, promovendo uma maior indução de diferenciação em células específicas (condrócitos, osteócitos e adipócitos) comparada com a população total de MSC. Análises de citometria de fluxo mostraram que os aptâmeros candidatos se ligam a 50% das MSC de polpa de dente e não apresentam taxa de ligação significante para fibroblastos e linfócitos de origem humana - utilizados como controles negativo. Além domais, imagens de imunofluorescência e confocal mostraram ligação na superfície da membrana de MSC e a marcação interna de monócitos a estes aptâmeros. Portanto, um aptâmero controle (CNTR APT) foi utilizado para comparar a especificidade dos aptâmeros ligados a células viáveis, mostrando a não ligação deste aptâmero a MSC. Porém, 40% da população de monócitos ligou-se ao CNTR APT. Uma normalização baseada na comparação entre as taxas de ligação entre células ligadas com aptâmeros candidatos e o aptâmero controle gerou uma taxa de especificidade entre 10-16 vezes maior para MSC contra 2,5 vezes para os monócitos. Deste modo, embora os resultados tenham mostrado uma taxa de ligação entre monócitos e aptâmeros, as MSC ligadas aos aptâmeros candidatos possuem uma maior taxa de especificidade devido a uma maior presença de antígenos que são expressos em ambas as células. Um ensaio de Pull Down seguido de espectrometria de massas foi utilizado para a identificação de biomarcadores que se ligariam aos aptâmeros candidatos, e que não seriam co-expressos por monócitos e por antígenos ligados ao aptâmero controle. Deste modo, a proteína ADAM17 foi identificada nas amostras de APT10 ligadas às MSC. Tal proteína está relacionada à inibição de uma cascata de sinalização da família de proteínas TGF, responsável pela diferenciação de MSC. Assim, MSC com maior potencial tronco deveriam expressar ADAM17 em maior quantidade. Tal proteína apresenta um sítio catalítico que demonstra interagir com o APT10, de acordo com predição Docking entre proteína e DNA. Foi identificada também, a proteína VAMP3, que pertence a um complexo proteico transmembranar responsável pelos processos de endocitose e exocitose, e que podem ter um papel importante na liberação de citocinas e outras moléculas relacionadas às respostas imune e inflamatórias. Deste modo, o APT10 identificou proteínas importantes que devem estar relacionas com a melhora de imunoterapias que utilizam MSC

Effect of low intensity photobiomodulation associated with norbixin-based poly (hydroxybutyrate) membrane on post-tenotomy tendon repair. In vivo study

Abstract Purpose: To evaluate the in vivo response of photobiomodulation therapy associated with norbixin-based poly(hydroxybutyrate) membrane (PHB) in tenotomized calcaneal tendon. Methods: Thirty rats were randomly allocated to six groups (n=5 each): LED groups (L1, L2 and L3) and membrane + LED groups (ML1, ML2 and ML3). The right calcaneal tendons of all animals were sectioned transversely and were irradiated with LED daily, one hour after surgery every 24 hours, until the day of euthanasia. At the end of the experiments the tendons were removed for histological analysis. Results: The histological analysis showed a significant reduction in inflammatory cells in the ML1, ML2 and ML3 groups (p=0.0056, p=0.0018 and p<0.0001, respectively) compared to those in the LED group. There was greater proliferation of fibroblasts in the ML1 (p<0.0001) and L3 (p<0.0001) groups. A higher concentration of type I collagen was also observed in the ML1 group (p=0.0043) replacing type III collagen. Conclusion: Photobiomodulation in association with norbixin-based PHB membrane led to control of the inflammatory process. However, it did not favor fibroblast proliferation and did not optimize type I collagen formation in the expected stage of the repair process.

Graves' ophthalmopathy: low-dose dexamethasone reduces retinoic acid receptor-alpha gene expression in orbital fibroblasts

ABSTRACT Objective: Graves' ophthalmopathy (GO) is an autoimmune disease that leads to ocular proptosis caused by fat accumulation and inflammation, and the main treatment is corticosteroid therapy. Retinoid acid receptor-alpha (RARα) seems to be associated with inflammation and adipocyte differentiation. This study aimed to assess the effect of glucocorticoid treatment on orbital fibroblasts of GO patient treated or not with different glucocorticoid doses. Materials and methods: Orbital fibroblasts collected during orbital decompression of a female patient with moderately severe/severe GO were cultivated and treated with 10 nM and 100 nM dexamethasone (Dex). rRARα gene expression in the treated and untreated cells was then compared. Results: Fibroblast RARα expression was not affected by 100 nM Dex. On the other hand, RARα expression was 24% lower in cells treated with 10 nM Dex (p < 0.05). Conclusions: Orbital fibroblasts from a GO patient expressed the RARα gene, which was unaffected by higher, but decreased with lower doses of glucocorticoid.

Immunolocalization of FGF-2 and VEGF in rat periodontal ligament during experimental tooth movement

OBJECTIVE: This article aimed at identifying the expression of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the tension and pressure areas of rat periodontal ligament, in different periods of experimental orthodontic tooth movement. METHODS: An orthodontic force of 0.5 N was applied to the upper right first molar of 18 male Wistar rats for periods of 3 (group I), 7 (group II) and 14 days (group III). The counter-side first molar was used as a control. The animals were euthanized at the aforementioned time periods, and their maxillary bone was removed and fixed. After demineralization, the specimens were histologically processed and embedded in paraffin. FGF-2 and VEGF expressions were studied through immunohistochemistry and morphological analysis. RESULTS: The experimental side showed a higher expression of both FGF-2 and VEGF in all groups, when compared with the control side (P < 0.05). Statistically significant differences were also found between the tension and pressure areas in the experimental side. CONCLUSION: Both FGF-2 and VEGF are expressed in rat periodontal tissue. Additionally, these growth factors are upregulated when orthodontic forces are applied, thereby suggesting that they play an important role in changes that occur in periodontal tissue during orthodontic movement. .

OBJETIVO: o objetivo desse estudo foi identificar a expressão do fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2) e do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) nos lados de tensão e pressão do ligamento periodontal de ratos, durante movimento ortodôntico experimental, em diferentes períodos de tempo. MÉTODOS: uma força ortodôntica de 0,5N foi aplicada no primeiro molar superior direito de 18 ratos Wistar machos, por períodos de 3 (grupo I), 7 (grupo II) e 14 dias (grupo III). O primeiro molar do lado oposto foi utilizado como controle. Os animais foram sacrificados nos períodos de tempo mencionados, sendo a arcada superior removida e fixada. Após a desmineralização, os espécimes foram processados histologicamente e embebidos em parafina. A expressão do FGF-2 e do VEGF foram estudadas por meio de análise imuno-histoquímica. RESULTADOS: o ligamento periodontal dos dentes submetidos à movimentação ortodôntica mostraram maior expressão tanto de FGF-2 quanto de VEGF, em todos os grupos experimentais, quando comparados com os dentes do lado controle (p < 0,05). Diferenças estatisticamente significativas entre os lados de tensão e pressão também foram encontradas nos dentes submetidos à movimentação ortodôntica. CONCLUSÕES: tanto o FGF-2 quanto o VEGF são expressos no tecido periodontal de ratos, e esses fatores de crescimento são aumentados quando forças ortodônticas são aplicadas, sugerindo que esses desempenham um papel importante na reorganização do periodonto durante o movimento ortodôntico. .

Nuevo método de reprogramación célular: para obtener células madre pluripotentes a partir de células somáticas: descubierto por investigadores de la Universidad de Pekín / New reprogramming method to get pluripotent stem cells: from somatic cells: discovered by Pekin University researchers

Se reseña la publicación de un importante trabajo donde se reporta el éxito obtenido por científicos chinos utilizando sustancias de bajo tamaño molecular, que actúan como reguladores de enzimas y de procesos bioquímicos de señalización, en la reprogramación de células diferenciadas de ratón para convertirlas en células madre pluripotentes similares a las células madre embrionarias y a las células madre pluripotentes inducidas por genes de factores de transcripción. Se hace referencia a las publicaciones previas de los investigadores que lograron por primera vez el mismo propósito con diferentes métodos. Se comentan las ventajas del nuevo método.

This is a review of an important publication by Chinese scientists about the successful reprogramming of differentiated murine cells to pluripotent stem cells that resemble embryonic stem cells using small-molecule compounds that act as regulators of enzymes and signaling pathways. Reference is made of previous publications by researchers who achieved for the first time the same goal by different methods. Comments on the advantages of the new method are included.

Análise histológica e morfométrica da área cruenta tratada com membrana de silicone: estudo em ratos / Histological and morphometric analysis of the raw areas treated with a silicone membrane: study in rats

OBJETIVO: o estudo avaliou o efeito da membrana de silicone no tratamento de área cruenta de ferimento. MÉTODO: O estudo experimental foi realizado com 30 ratos Wistar, machos, divididos igualmente em três grupos: no grupo G G, a área cruenta foi tratada com gazes; no grupo G H, com enxerto homólogo de pele; e no grupo G S, com membrana de silicone. Após 14 dias de pós-operatório, os animais foram mortos para a realização do estudo. Os atributos estudados foram a variação da massa corporal dos animais; o estudo histológico quantificado por análise morfométrica, avaliando o número de neovasos, fibroblastos, fibras colágenas, leucócitos e monócitos; e a medida da espessura da área cruenta através de régua micrométrica. Os dados foram submetidos à análise estatística. RESULTADOS: Não houve diferença significativa entre as massas dos animais. Observou-se predomínio de neovasos, fibroblastos e espessura de área cruenta nos animais do grupo G S. Houve predomínio de leucócitos e monócitos nos animais do grupo G H. Também foi observado que não houve diferença significativa entre os grupos quanto às fibras colágenas. CONCLUSÃO: A membrana de silicone proporcionou tecido de granulação com maior número de neovasos, fibroblastos e maior espessura.

BACKGROUND: This study evaluated the effects of a silicone membrane on the treatment of the raw flesh area in wounds. METHODS: The experimental study was carried out with 30 male Wistar rats divided into three groups: in the G G group, the raw area was treated with gauze, in the G H group with homograft, and in the G S group with a silicone membrane. Animals were sacrificed at fourteen days of postoperative. The studied attributes were body mass variation, histological study quantified by morphometric analysis evaluating the number of neovessels, fibroblasts, collagen fibers, leucocytes, monocytes; and using a micrometric ruler measurement of the raw area's thickness. Data were then submitted to statistical analysis. RESULTS: There was no significant difference between the animals' mass (p=0.0685). Predominance of neovessels (p<0.01), fibroblasts (p<0.001) and thickness of the raw flesh were observed in G S animals. There was predominance of leucocytes (p<0.021) and monocytes (p<0.0001) in G H animals. Also, no significant difference between the groups as for collagen fibers (p=0.0536) was observed. CONCLUSION: The silicone membrane promoted granulation tissue with a large number of neovessels, fibroblasts and greater thickness.

Comparison between textured silicone implants and those bonded with expanded polytetrafluoroethylene in rats

PURPOSE: Comparison of the inflammatory reaction promoted by textured silicone implants and that caused by the implant bonded with e-ptfe. METHODS: One-hundred and fifty rats were divided into three equal groups (control, silicone, and bonded e-ptfe). These groups were subdivided into five groups, according to the second operation, i.e., 7,30,60,90 and 180 days. Histology of the peri-implant tissue was analyzed by morphometry with blood count (neutrophilos, lymphocytes, macrophages, fibroblasts and capillaries). RESULTS: Comparison of subgroups 7,30,60,90, 180 days: - neutrophils: silicone: > in subgroup 7 days; bonded e-ptfe: > in subgroups 7 and 30 days; - lymphocytes: silicone: > in subgroup 7 and 180 days; bonded e-ptfe: > in subgroup 180 days; - macrophages: silicone: > in subgroup 7 and 60 days; bonded e-ptfe: > in subgroup 7,30 and 60 days; - fibroblasts: silicone: > in subgroup 30 and 60 days;- vascular volume: silicone: in subgroup 7, 60 and 90 days; bonded e-ptfe: > in subgroup 7 days. Comparison of groups: neutrophils : 7 days: > in silicone and bonded e-ptfe; 30 days: > in bonded e-ptfe; - lymphocytes: - 7,30,90 and 180 days: in the control; macrophages: - 7,30 and 60 days: > in silicone & bonded e-ptfe; 180 days > in silicone; fibroblasts: - 7,30 and 90 days: > in silicone and bonded e-ptfe; 180 days: > in bonded e-ptfe; vascular volume 7,60,90 and 180 days: > in silicone and bonded e-ptfe; 30 days: > in bonded e-ptfe. CONCLUSIONS: The acute stage of the inflammatory response was more severe and irregular in the silicone implant; both the silicone implant and the silicone bonded with e-ptfe promoted chronic inflammatory reaction and weak foreign body inflammatory response. These reactions were greater in the silicone implant group.

OBJETIVO: Comparar a reação inflamatória provocada pelo implante de silicone texturizado, com aquela causada por este recoberto com PTFE-E. MÉTODOS: Foram utilizadas 150 ratas, divididos em três grupos igruais (controle, silicone e recoberto PTFE-E). Os grupos foram subdivididos em cinco subgrupos, ou seja, 7, 30, 60, 90 e 180 dias, de acordo com a data do segundo ato operatório. O tecido perimplante foi analisado histologicamente, por meio de técnica morfométrica, com contagem de neutrófilos, linfócitos, macrófagos, fibroblastos e capilares. RESULTADOS: Comparação dos subgrupos 7, 30, 60, 90 180 dias: - neutrófilos - silicone: > no subgrupo 7 dias; rec-ptfe: > nos subgrupos 7 e 30 dias; - linfócitos: silicone: > no subgrupo 7 e 180 dias; rec-ptfe: > no subgrupo 180 dias; - macrófagos: silicone: > no subgrupo 7 e 60 dias; rec-ptfe: > no subgrupo 7, 30 e 60 dias; - fibroblastos: silicone: > no subgrupo 30 e 60 dias; - volume vascular: silicone: > no subrupo 7, 60 e 90 dias; rec-ptfe: > no subgrupo 7 dias . Comparação dos gurpos: - neutrófilos - 7 dias: > no silicone e rec-ptfe; 30 dias: > no rec-ptfe; - linfócitos - 7, 30, 90 e 180 dias: > no controle; - macrófagos - 7, 30 e 60 dias: > no silcone e rec-ptfe; 180 dias: > no silicone; - fibroblastos - 7, 30 e 90 dias: > no silicone e rec-ptfe; 180 dias: > no rec-ptfe; - volume vascular - 7, 60, 90 e 180 dias: > no silicone e rec-ptfe; 30 dias: > no rec-ptfe. CONCLUSÕES: A fase aguda da reação inflamatória foi mais intensa e irregular no implante de silicone; tanto o implante de silicone como o de silicone recoberto por ptfe-e induziram a reação inflamatória crônica e a fraca reação inflamatória tipo corpo estranho. Estas forram maiores no implante de silicone.

Gene expression profiling in wild-type and metallothionein mutant fibroblast cell lines

The role of metallothioneins (MT) in copper homeostasis is of great interest, as it appears to be partially responsible for the regulation of intracellular copper levels during adaptation to extracellular excess of the metal. To further investigate a possible role of MTs in copper metabolism, a genomics approach was utilized to evaluate the role of MT on gene expression. Microarray analysis was used to examine the effects of copper overload in fibroblast cells from normal and MT I and II double knock-out mice (MT-/-). As a first step, we compared genes that were significantly upregulated in wild-type and MT-/- cells exposed to copper. Even though wild-type and mutant cells are undistinguishable in terms of their morphological features and rates of growth, our results show that MT-/- cells do not respond with induction of typical markers of cellular stress under copper excess conditions, as observed in the wild-type cell line, suggesting that the transcription initiation rate or the mRNA stability of stress genes is affected when there is an alteration in the copper store capacity. The functional classification of other up-regulated genes in both cell lines indicates that a large proportion (>80 percent) belong to two major categories: 1) metabolism; and 2) cellular physiological processes, suggesting that at the transcriptional level copper overload induces the expression of genes associated with diverse molecular functions. These results open the possibility to understand how copper homeostasis is being coordinated with other metabolic pathways.

Effects of long-term cyclosporin therapy on gingiva of rats: analysis by stereological and biochemical estimation

A ciclosporina A (CsA) é usada como um agente imunossupressor e promove efeitos colaterais como o crescimento gengival que permanece um problema significante. Alguns fatores de risco podem aumentar esses efeitos, como a duracão do tratamento. Ainda não há estudos estereológicos e bioquímicos explorando os efeitos de um longo período de terapia com CsA no tecido gengival. O objetivo do presente estudo foi investigar o nível de TGF-b1 na saliva e descobrir a densidade de fibroblastos e fibras colágenas no tecido gengival de ratos tratados por um longo período com CsA. Os ratos foram tratados por 60, 120, 180 e 240 dias com injecões subcutâneas diárias de 10 mg/kg de peso corporal de CsA. Ao final dos períodos experimentais, a saliva era coletada para determinacão do TGF-b1. Após o processamento histológico, o epitélio oral e a área do tecido conjuntivo foram medidos, bem como a densidade volumétrica dos fibroblastos (Vf) e das fibras colágenas (Vcf). Após 60 e 120 dias de tratamento com CsA ocorreu um significante aumento de Vf e Vcf, bem como aumento significante de TGF-b1. Após 180 e 240 dias, houve reducão do crescimento gengival associada com decréscimo significante do nível de TGF-b1, e também diminuicão observada de Vf e Vcf. Os dados presentes neste estudo sugerem que, após longo período de terapia, ocorre uma diminuicão do nível de TGF-b1, o que deve contribuir para um aumento na atividade proteolítica dos fibroblastos na gengiva, favorecendo a normalidade da síntese da matriz extracelular.

Evidence for clustered mannose as a new ligand for hyaluronan- binding protein (HABP1) from human fibroblasts.

We have earlier reported that overexpression of the gene encoding human hyaluronan-binding protein (HABP1) is functionally active, as it binds specifically with hyaluronan (HA). In this communication, we confirm the collapse of the filamentous and branched structure of HA by interaction with increasing concentrations of recombinant-HABP1 (rHABP1). HA is the reported ligand of rHABP1. Here, we show the affinity of rHABP1 towards D-mannosylated albumin (DMA) by overlay assay and purification using a DMA affinity column. Our data suggests that DMA is another ligand for HABP1. Furthermore, we have observed that DMA inhibits the binding of HA in a concentration-dependent manner, suggesting its multiligand affinity amongst carbohydrates. rHABP1 shows differential affinity towards HA and DMA which depends on pH and ionic strength. These data suggest that affinity of rHABP1 towards different ligands is regulated by the microenvironment.

Deteccion de citomegalovirus mediante la tecnica de inmunoperoxidasa y aislamiento viral / Detection of citomegalovirus by immunoperoxidase technic and viral isolation

En el presente estudio se comparo la tecnica de inmunoperoxidasa para la deteccion de citomegalovirus (IPCMV) utilizando anticuerpos monoclonales que reconocen proteinas precoces virales con el metodo convencional de aislamiento viral en fibroblastos humanos. Un total de 150 muestras de orina fueron examinadas encontrando una sensibilidad de un 89.8 por ciento y una especificidad de 91.3 por ciento de la tecnica de IPCMV comparada con el aislamiento viral. Una de las ventajas que presento la IPCMV fue la rapidez con que fueron obtenidos los resultados (48 horas) mientras que el aislamiento viral fue como promedio 14 dias.